La bioseguridad es un conjunto de protocolos establecidos para garantizar protección a toda la comunidad que utiliza el servicio, basada en conceptos científicos para reducir el riesgo biológico. Objetivo: Describir el conocimiento de los funcionarios sobre bioseguridad en ambiente hospitalario del Hospital Regional del Instituto de Previsión Social de Ciudad del Este. Materiales y métodos: Estudio observacional, descriptivo y de corte transversal, mediante un cuestionario estructurado sobre actuación ante accidentes, vacunación y uso de equipos de protección individual (EPI). Resultados: Fueron analizados 14 funcionarios del sector de mantenimiento; la mayoría conocía claramente los EPI y su procedimiento correcto de uso, la primera acción ante accidentes con punzocortantes y el tiempo máximo para iniciar la profilaxis. Conclusión: El cuestionario tuvo una buena aceptabilidad entre los funcionarios; la mayoría utiliza el EPI correctamente, conoce la profilaxis adecuada y a quién recurrir ante un accidente laboral.